张绍阳 0524 《分子生物学》实验讲稿0223_分子生物学实验讲义总
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讲 稿
课 程 分子生物学 实验 专 业 生物科学科 年 级 2010级 教 师 张 绍 阳 职 称、学 位 讲 师 博 士 部系、教研室 生物科学与化学系植物教研室
2012至2013学年度第二学期
实验1 CTAB法提取植物基因组DNA
一、实验目的和原理基因组DNA提取实验意义
基因组DNA提取是植物生物技术的基本环节，所得DNA可用于基因克隆、分子标记分析、基因文库构建以及Southern杂交等试验操作。2 基因组DNA提取方法
关于植物基因组DNA提取的方法有诸多文献报道，但基本步骤和原理是相近的，其提取液主要成份不外乎两种试剂，即十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethyl-ammonium bromide，CTAB）和十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS），并以CTAB为多。本次实验介绍CTAB法提取植物基因组DNA原理和相应方法。基因组DNA提取CTAB法基本原理
植物组织是由多种组分构成的，如糖、脂类、蛋白质、DNA和RNA构成。提取基因组DNA就是要先将组织细胞进行破碎，然后通过试剂作用和离心作用将其余杂质去除。植物组织经液氮粉碎后用含表面活性剂的CTAB提取液提取，经氯仿抽提，DNA和RNA得到回收而蛋白质及细胞碎片和脂溶性杂质得到去除。经有机溶剂沉淀，DNA和RNA得以沉淀而水溶性杂质被去除。RNA经RNase处理可被降解，最终获得基因组DNA。
以下是提取方法和基本步骤。
4.本实验要掌握事项：移液器使用注意事项、离心机操作注意事项
二、实验材料、试剂、仪器及用具
1.实验材料及选取标准：健康无病虫害的植物鲜嫩组织，通常是芽和未完全展开的幼叶。思考题：为什么要选用鲜嫩组织？说明不同植物材料DNA提取难易程度有显著差别。本实验实验材料为：青瓯柑幼叶。
2.试剂种类及其作用
2.1 试剂种类： 液氮、2×CTAB提取缓冲液、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（水不溶性）、β-巯基乙醇、氯仿:异戊醇（24:1）、酚: 氯仿:异戊醇（25:24:1）、异丙醇、70%乙醇、RNase（10mg/ml）、TE缓冲液等。
2.2 试剂作用：（1）液氮和PVP。液氮就是保持研磨时低温降低组织内生理生化反应，同时使得组织变脆易于研磨。PVP是防止组织发生醌类反应而褐化。（2）2×CTAB提取缓冲液（由2% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl , 20 mmol/L EDTA, 1.4 mol/L NaCl, pH 8.0)，其作用就是细胞破碎，基因组DNA从核内游离出来；其中，EDTA成分为DNase抑制剂，防止DNA被该酶降解。β-巯基乙醇，在提取前CTAB溶液中，具有抑制氧化作用，其具有臭鸡蛋难闻气味。加入该试剂要在通风厨内进行。
（3）氯仿:异戊醇（24:1），该溶液密度比水大，其作用去除叶绿素等脂溶性物质，包括糖和大部分蛋白质。
（4）RNase A ,其作用就是去除RNA（5）酚: 氯仿:异戊醇（25:24:1）,去除蛋白质，尤其是染色体上的组蛋白（6）异丙醇，使DNA沉淀。用前要-20度低温遇冷半小时或更长时间。（7）乙醇，漂洗DNA，使得到的DNA更为纯净
（8）TE缓冲液（10 mM Tris和 1 mM EDTA，pH8.0）。溶解DNA。溶解完毕的DNA溶液，即为最终提取产物。也可以用超纯水（或双蒸水）进行溶解。在TE缓冲液中，DNA更为稳定。
3.仪器及用具：冷冻离心机、研钵、移液器、通风厨、水浴锅等。分子生物学实验中，氯仿、甲醛、醋酸、-巯基乙醇，都具有刺激性气味，进行相关操作时要在通风厨内进行。
三、实验步骤（实验操作顺序，以一A1小小组为例）
1.一A1-1 加提取缓冲液。将600 l 2×CTAB提取缓冲液和20 l -巯基乙醇加入1.5 ml 离心管中（在通风厨内进行）, 将该离心管放入65℃水浴中进行预热。
2.液氮研磨组织。取适量植物组织（约0.5-1.0g），加入适量PVP，于液氮中研磨成粉末。（已有研磨好样品，在本实验中，此步骤已省略）
3.一A1-2 65℃水浴45-60 min。取0.10-0.12g研磨好的组织粉末，转入提取液已预热过的离心管中，盖好盖子后，旋窝震荡10-15s左右，然后随浮板放入在65℃水浴中保温45-60 min, 并每隔10-15min颠倒混匀10次左右。（待水浴完成后，将温度设置为37℃，加入适量水，使其水温降到37℃，以备后续RNA消解用）
4.一A1-3 等体积氯仿:异戊醇（24:1）抽提。加600 l 氯仿:异戊醇（24:1）到管中（在通风厨内进行），盖紧离心管盖，颠倒混匀50-100次，12000 rpm 离心10 min。（在本实验中，4℃12000 rpm离心10min，只有异丙醇沉淀所必需，其他相应操作可以不采用此条件。但为方便起见，均采用此条件）
5.一A1-1 RNase消解RNA。吸取500 l上清液（注意不要洗到下层溶液）转入新的离心管中。（注A4和A5在此可直接跳到步骤6）。加入0.5 l RNase溶液，颠倒混匀后，随浮板放入37℃水浴锅内，放置30min。
6.一A1-2 酚: 氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提。加入500 l（在通风厨内进行），盖紧离心管盖，颠倒混匀50-100次，12000 rpm 离心10 min。
7.一A1-3 异丙醇沉淀。用1 ml 移液器吸取400 l上清液（注意不要洗到下层溶液）转入新的离心管中，加入等体积的已遇冷的异丙醇，盖紧离心管盖，轻轻颠倒1-2次，-20℃冰柜内放置30 min左右，然后于4℃下12000 rpm离心10 min。
8.一A1-1 70%乙醇漂洗两次。小心倒弃上清液，在含DNA沉淀的离心管中加入1 ml 70%乙醇，轻轻颠倒1次，小心倒弃上清液，此为一次漂洗。重复一次漂洗。然后，短暂离心，充分吸弃残液，敞开离心管口，散除乙醇10-15min；
9.一A1-2 TE缓冲液溶解DNA。加入30-50 l TE缓冲液（10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA，pH8.0），用移液器吸头轻柔吸打溶解沉淀，沉淀溶解后，即为DNA提取产物，DNA提取到此结束；取5l 产物用于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，其余放置在-20℃冰柜保存备用。DNA琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光度计检测，见后续实验。
四、思考题与作业
1.把你认为在实验过程中最应该注意的事项写下来。实验2 核酸琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的和原理
核酸电泳是分子生物学实验室最频繁的基本操作之一，它可用于分析核酸片段的长度从而检查特定长度的目的核酸片段是否存在，也可用于判断核酸的质量（如有无严重多糖污染）和降解程度，它也常用于粗略估计核酸的浓度以及用于核酸片段的纯化。
核酸为多元酸，具有较强的酸性，因此在呈碱性的电泳缓冲液中带有正电荷，在电场作用下由负极向正极移动，核酸在琼脂糖凝胶中的泳动距离与凝胶浓度、核酸长度和构象等因素相关。线性核酸在凝胶中的泳动距离与核酸长度的对数呈线性负相关，根据这一特性，可以依据已知长度的核酸标准物计算目的条带的长度。本实验的目的是掌握核酸琼脂糖凝胶电泳的原理、影响因素及其应用。
二、实验材料、试剂、仪器及用具
1.材料：先前实验获得的DNA或RNA样品。本实验为青瓯柑基因组DNA。2.试剂：琼脂糖、1倍TAE 缓冲液、溴化乙锭（EB）、6 倍 loading buffer、DNA Marker(本实验用DL 2000 和 λ-Hind III，如下图所示)等。
3.仪器及用具：电泳仪、水平电泳槽、紫外分析仪（或手提紫外灯）、凝胶成像系统、微波炉等。
三、实验步骤（有待调整，见5月25日早上正式版本；先看先了解）1.根据胶模面积计算制备琼脂糖凝胶所需体积，控制凝胶的厚度在5-7mm左右。取所需体积的1×TAE电泳缓冲液（50×TAE电泳缓冲液的配法：24.2克Tris，3.72克EDTANa2•2H2O，加适量水，搅拌并稍加热溶解后加5.71ml冰乙酸，加水至100 ml）于合适大小的三角瓶中。
[提示：（1）凝胶过薄影响点样体积以及凝胶强度，低于1%的琼脂糖凝胶宜厚些。过厚导致凝胶成像时背景较深且易导致条带变得模糊（由于上下泳动速度不完全一致所致）；（2）琼脂糖凝胶电泳可采用的电泳缓冲液包括1×TAE和0.5×TBE，但后者不适于从琼脂糖凝胶中回收DNA的操作，故实验室统一作用1×TAE为佳；（3）三角瓶的容量以达到电泳缓冲液的3-5倍以上为佳。] 2.根据所分离核酸片段大小确定琼脂糖凝胶浓度，具体如下。
基因组DNA（约50 kb）
0.7%
质粒（＞3kb）、RNA
0.8%
1000-3000 bp
1.0%
500-1000 bp
1.5%
2.0%
[提示：（1）凝胶浓度过低会导致凝固不良或凝胶强度低，而过高则会导致凝胶成像时背景较深；（2）浓度使用不当会导致条带间分离不良；（3）低于300 bp的片段进行电泳时条带间往往难以获得良好分离，使用高分辨率琼脂糖可改善短片段间的分离效果，从而可应用于AFLP或SSR产物的电泳，但所使用的浓度相应提高。] 3.根据上两步骤确定琼脂糖用量，称取琼脂糖倒入已装有电泳缓冲液的三角瓶中，混匀，置微波炉中加热至微沸或接近微沸，取出，再次混匀，再用微波炉加热至沸腾，取出，若溶液中尚有琼脂糖颗粒的迹象，需重复加热步骤。
[提示：（1）琼脂糖的充分熔化对于最终电泳图片的质量十分重要。多次反复加热比一次持续加热更有利于琼脂糖的熔化且可避免琼脂糖溶液在沸腾时溢出；（2）选择具透明炉门的微波炉有利于避免因过度沸腾导致的溶液溢出；（3）需戴防热手套以防烫伤。] 4.取出三角瓶，在室温放置0.5-1 min，然后加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5 g/ml，迅速混匀，然后将琼脂糖溶液倒入胶模并插入电泳梳子。
[提示：（1）EB为致癌物质，操作时需戴乳胶手套。EB在沸腾的琼脂糖溶液中易挥发，因此，在室温放置琼脂糖溶液0.5-1 min使温度稍降之后加入EB为佳。已添加EB的凝胶不宜再次熔化以避免EB挥发；（2）EB通常配制成10 mg/ml的贮存液，因此，每100 ml凝胶溶液中加入5 l贮存液即可。] 5.待琼脂糖凝胶充分凝固后方可用于电泳。拔出电泳梳子，将凝胶连胶模放入电泳槽，点样孔一端靠负极，倒入1×TAE电泳缓冲液至高出凝胶表面0.5 cm。
[提示：（1）琼脂糖的充分凝固对于最终电泳图片的质量十分重要。夏天低浓度琼脂糖凝胶的凝固需要较长时间，可在凝胶基本凝固后将凝胶连胶模放入4℃冰箱加速凝固；（2）凝胶长时间（如过夜）不用时需用保鲜膜包裹以防止水分蒸发，且不应拔下电泳梳子。] 6.将5-10 l样品与1-2 l 6×上样缓冲液（0.25%溴酚兰, 40%蔗糖）按大约5：1的比例混匀，然后点到凝胶点样孔中；
[提示：（1）上样体积宜根据核酸浓度确定，通常电泳条带的量以20-200 ng为宜，过小导致条带信号弱难以观察，过大导致条带间不易分离；（2）当上样体积较大时，可在制胶时使用梳孔较厚的梳子，但电泳分辨率不及梳孔较窄时；（3）随凝胶浓度不同，溴酚兰指标对应的DNA条带长度约为300-1000 bp，当溴酚兰与目的条带同一位置时会影响目的条带的荧光观察和摄像，此时可将上样缓冲液用40%蔗糖稀释3倍后使用；（4）出于DNA长度或浓度计算需要，需要同时点商业化的DNA Marker。] 7.点样完毕后开始电泳，电泳电压以5V/cm [即两电极间的长度（以cm为单位）×5为宜]。用紫外分析仪或手提紫外灯监测电泳进程，待条带间达到理想分离程度时停止电泳，进行凝胶摄像。
[提示：（1）电泳时间过短不利于条带分离，过长则易导致短片段条带变宽模糊且荧光信号变弱；（2）阅读凝胶摄像仪说明书，进行合理的参数设置对于获得理想图片十分重要。]
四、思考题与作业（可以思考，但不做要求）1.影响核酸泳动距离的因素有哪些？
2.如何根据电泳结果计算目标核酸片段的长度？ 3.如何获得一张理想的电泳图片？
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