仪器分析教案_仪器分析技术教案
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第三节 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
【教学目标】
1.掌握液-液分配色谱法及化学键合相色谱法的分离原理，分配系数、固定相的类型和特点 2.熟悉高效液相色谱法的主要类型 3.熟悉高效液相色谱法的主要类型
4.了解各类高效液相色谱法的特点及应用 【教学重点】
液-液分配色谱法及化学键合相色谱法；分离原理；分配系数 【教学难点】
分配系数；分配系数与组分流出顺序的关系 【复习题】
1.气相色谱法有哪几种类型？各类气相色谱法的固定相与流动相的类型是什么？ 2.各类气相色谱法的分离原理是什么？ 3.分配系数的定义是什么？意义是什么？
【讲授新课】
与气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是固定液、吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
根据其分离原理不同，高效液相色谱法可分为几种类型：
一． 液-液分配色谱法及化学键合相色谱法
（一）液-液分配色谱法
1.固定相：将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。
流动相：液体。
且要求，流动相液体与固定相液体互不相溶。
2．分离原理：溶解——溶解分配平衡过程（组分溶解在固定相中—组分溶解在流动相中），类似于液液萃取机理。
溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。
3.分配系数：
当样品中的被测定组分在固定相和流动相中达到动态平衡时，可以用分配系数来描述这个分配平衡过程：
其中，（1）分离的顺序决定于分配系数的大小：
固定相对某组分的溶解力大于溶剂对某组分的溶解力，K↑，后流出色谱柱 固定相对某组分的溶解力小于溶剂对某组分的溶解力，K↓，先流出色谱柱
（2）某色谱条件下，两组分分配系数差值为零，则代表两组分在该色谱条件下不能分离。4.分类：
正相液-液色谱法：固定相极性＞流动相极性，极性较小组分先出峰，极性较大组分后出峰 适于分离极性较强的物质
反相液-液色谱法：固定相极性＜流动相极性
极性较大组分先出峰，极性较小组分后出峰 适于分离非极性至中等极性的物质
（二）化学键合相色谱法：
（1）固定相：将固定液通过化学反应共价键合到担体（硅胶）表面作为固定相。
流动相：液体。
（2）分离原理：同液-液分配色谱法。（3）分配系数：同液-液分配色谱法。（4）分类：同液-液分配色谱法。
（三）液-液分配色谱法与化学键合相色谱法的对比
液-液分配色谱法 化学键合相色谱法 与担体结合方式 涂渍 共价键合柱效对比 较低 较高
固定液是否流失 是 否
能否进行梯度洗脱 否 能
另外，化学键合固定相表面固定液一般多为单分子层，因此无液坑，液层薄，传质速度快；且有载样量大，化学性能稳定，重现性高，色谱柱寿命长等优点。目前已经逐渐取代了传统的液液分配色谱，成为液相色谱法中使用最广泛的方法。
二．液-固吸附色谱法
1.固定相：液固吸附色谱法的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，在它的表面通常存在吸附中心点，可以有效地从气体或液体中吸附其中某些成分。流动相：液体
2.分离原理：吸附——吸附竞争平衡过程（组分吸附在固定相上—流动相吸附在固定相上）
流动相中的溶质分子X（流动相）被流动相S带入色谱柱后，在随流动相流动的过程中，发生如下交换反应：
其作用机制是被分离组分（溶质分子X）与流动相（溶剂分子S）争夺吸附剂表面吸附活性中心的结果（竞争吸附）。在这个过程中，交换能力较强的溶质分子会竞争得到更多的吸附中心点，从而在色谱柱中移动较慢，从而达到分离的目的。3.分配系数：
其中，（1）分离的顺序决定于分配系数的大小：
吸附剂对某组分的吸附力越强，K↑，后流出色谱柱 吸附剂对某组分的吸附力越弱，K↓，先流出色谱柱
（2）某色谱条件下，两组分分配系数差值为零，则代表两组分在该色谱条件下不能分离。
4.应用：
液固色谱法适用于分离分子量中等，能溶于有机溶剂的非离子性化合物，此外，液固色谱法对于分离具有不同官能团的结构相似的化合物、异构体有较高的选择性。
三．离子交换色谱法
1.固定相：是一种带电荷的官能团的固定基质，称为离子交换剂。为保证交换剂的电中性，基质上还存在带相反电荷的离子，称为反离子。
目前常用的三大类离子交换剂基质：合成树脂、纤维素、硅胶。流动相：具有一定pH和盐浓度的缓冲溶液
2.分离原理：吸附——吸附竞争平衡过程（反离子吸附在固定相上—组分离子吸附在固定相上）
在离子交换过程中，流动相中存在的被分析离子（M+）与树脂上吸附的反离子（Y-）之间发生竞争吸附，可用下列平衡表示：
阳离子交换： 阴离子交换：
被分离样品中不同离子对交换剂具有不同的亲和力，在发生竞争吸附时，不同的样品离子交换反离子的能力也不同。对交换剂亲和力较强的样品离子，交换反离子的能力较强，从而在色谱柱中迁移速度较慢，从而达到分离的目的。3.分配系数：
以阴离子交换平衡过程为例，分配系数：
其中，（1）分离的顺序决定于分配系数的大小：
溶质中某离子与离子交换剂的相互作用越强，K↑，后流出色谱柱 溶质中某离子与离子交换剂的相互作用越弱，K↓，先流出色谱柱
（2）某色谱条件下，两组分分配系数差值为零，则代表两组分在该色谱条件下不能分离。
4.应用：
离子交换色谱法特别适用于分离离子化合物、有机酸和有机碱等能电力的化合物和能与离子基团相互作用的化合物。它不仅广泛地应用于有机物质，而且广泛地应用于生物物质的分离，如氨基酸、核酸、蛋白质等生物分子，还能用于维生素的混合物、食品防腐剂、血清等的分离。5.分类：
阳离子交换色谱和阴离子交换色谱
【小结】
1． 固定相：
液-液分配色谱法 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相
化学键合相色谱法 将固定液通过化学反应共价键合到担体（硅胶）表面作为固定相 液-固吸附色谱法 吸附剂 离子交换色谱法 离子交换剂 2．分离原理
液-液分配色谱法 溶解——溶解分配平衡过程（组分溶解在固定相中—组分溶解在流动相中）化学键合相色谱法 溶解——溶解分配平衡过程（组分溶解在固定相中—组分溶解在流动相中）液-固吸附色谱法 吸附——吸附竞争平衡过程（组分吸附在固定相上—流动相吸附在固定相上）离子交换色谱法 吸附——吸附竞争平衡过程（反离子吸附在固定相上—组分离子吸附在固定相上）3．各种色谱法的分配系数表示方法虽各不相同，但分配系数与组分流出顺序的关系均可表述为，组分K↑，后流出色谱柱；组分K↓，先流出色谱柱。
【作业】
课后习题2、6、9。
第九节 高效液相色谱法在食品检测中的应用
【教学目标】
1.了解高效液相色谱法在食品检测中的具体应用实例
2.能够通过实例系统地了解之前所学关于高效液相色谱法的具体内容 3.了解食品高效液相色谱法前处理知识 【教学重点】
外标法定量的运用 【教学难点】
不同定量方法的运用 【复习题】
1.液相色谱法的主要定量方法包括哪几种？
【讲授新课】
5.动物源食品呋喃唑酮残留量的测定
呋喃唑酮（痢特灵）是一种抗菌效果非常好的广谱抗生素药物，曾被广泛应用于家禽、家畜、水产品中的疾病预防和治疗。近年的研究表明，呋喃唑酮及其代谢物具有致基因突变和致癌性。美国1993年禁止呋喃唑酮作为兽药，欧盟将其列为违禁药品，我国农业部第235号公告中也规定动物性食品中呋喃唑酮检出限为不得检出。
（一）原理：反相色谱法
（二）色谱条件：
固定相：C18柱
流动相：乙腈—磷酸溶液 检测器：Uv-vis检测器 检测波长：367nm 流速：1.0ml/min 进样量：20ul
（三）测定方法： 1．试样前处理：
固体试料破碎→混合→初分离→浓缩→再分离→过滤→供试样液
2．测定方法（外标法）：
（1）标准对照品溶液的配制与测定：精密称取呋喃唑酮标准对照品适量，配制成一定浓度的溶液Cs。在上述色谱条件下得到色谱流出曲线，呋喃唑酮的保留时间在4.5min附近，得到呋喃唑酮峰的峰面积As。
（2）样品溶液测定：试样溶液在上述色谱条件下分离得到试样的色谱流出曲线，得到试样中呋喃唑酮的峰面积Ax。
（3）外标法计算：利用下式即可计算的出样品中的呋喃唑酮含量
二．高效液相色谱测定保健食品中的黄芪甲苷
黄芪是多年生草本豆科植物，药用历史悠久、广泛。皂苷是黄芪中的主要有效成分之一，而黄芪皂苷以黄芪甲苷为主。黄芪甲苷具有增强机体免疫力、抗氧化、促进细胞生长，抑制内毒素等作用。所以在一些保健食品中，黄芪甲苷作为功能性添加剂成分有添加。例如，蜂胶黄芪软胶囊、虫草鸡精口服液。
（一）原理：反相色谱法
（二）色谱条件：
固定相：C18柱 流动相：乙腈—水
检测器：二极管阵列检测器 检测波长：227nm 流速0.8ml/min 进样量：10ul
（三）测定方法（外标法峰面积标准曲线法）： 1．试样前处理：
虫草鸡精口服液试样→浓缩→定容→过柱（大孔吸附树脂）→浓缩→过滤→供试样液 2．测定方法：
（1）标准对照品溶液的配制与测定：精密称取黄芪甲苷标准对照品适量，配制为浓度从低到高的一系列溶液C1……C5（5.0，10.0，20.0，40.0，50.0μg/mL）。在上述色谱条件下依次得到相应色谱流出曲线，并得到峰面积A1……A5。
（2）标准曲线的绘制：以峰面积A对浓度进行线性回归，得线性回归方程，即为标准曲线。
（3）样品溶液测定：在标准曲线的线性范围内，加载供试样液，得到样品色谱流出曲线，测量其中黄芪甲苷对应峰的峰面积。
将样品黄芪甲苷峰的峰面积带入线性回归方程，利用标准曲线法即可算出样品中的黄芪甲苷含量。
三．高效液相色谱法同时进行测定食品中安赛蜜、糖精、苯甲酸、山梨酸和咖啡因
食品添加剂若使用不当，添加过量，就会对人体产生毒副作用。
（一）原理：反相色谱法
（二）色谱条件：
固定相：C18柱
流动相：甲醇—柠檬酸铵 检测器：Uv-vis检测器 检测波长215nm 流速1.0ml/min 进样量20μL 柱温40℃
（三）测定方法： 1．试样前处理：
（1）乳状液体样品（果奶、冰淇淋等）：
试样→沉淀蛋白质→过滤、脱气→供试样液
（2）澄清液体样品（汽水、可乐等）：
试样→脱气→稀释→过滤→供试样液
（3）固状样品（肉制品、酱脆菜等）：
试样→捣碎→加入溶剂→沉淀蛋白质→过滤、脱气→供试样液
2．测定方法（外标法峰高标准曲线法）：
（1）标准溶液配制：使用流动相配制安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、咖啡因标准溶液（1mg/mL），将各标准液按照安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、咖啡因比例依次为5.0、4.0、5.0、5.0、5.0μg/mL混合，得到混合标准溶液。将混合标准溶液用水稀释成6个浓度C1……C6
（2）确定成分峰位置：首先用各自的标准溶液稀释，在色谱条件下进行分析，定性确定每个峰对应的成分。
（3）标准曲线：在上述色谱条件下，6个浓度的混合标准溶液分别得到相应色谱流出曲线，并得到峰高h1……h6。以峰高h对含量进行线性回归，得各种标准物质的线性回归方程，即为标准曲线。
（4）样品溶液测定：在标准曲线的线性范围内，加载供试样液，得到每种样品的色谱流出曲线，测量其中添加剂对应峰的峰高。
将样品添加剂相关峰的峰高带入线性回归方程，利用标准曲线法即可算出样品中各种添加剂的含量。
四．反相高效液相色谱法测定巧克力中香兰素
香兰素是重要的食用香料之一，是食用调香剂，具有香荚兰豆香气及浓郁的奶香，是食品添加剂行业中不可缺少的重要原料，广泛运用在各种需要增加奶香气息的调香食品中，香兰素是国家允许添加的食品添加剂，按国标添加不会对身体造成伤害。但大剂量食用可导致头痛、恶心、呕吐、呼吸困难，甚至损伤肝肾等。
（一）原理：反相色谱法
（二）色谱条件：
固定相：C18柱 流动相：甲醇—水 检测器：Uv-vis检测器 检测波长：280nm 流速：1.0ml/min 进样量：10μL 柱温：35℃
（三）测定方法： 1．试样前处理：
巧克力样品→加水加温溶解→定容→离心取上层清液→过滤→供试样液
2．测定方法：
外标法峰面积标准曲线法定量
参见实验二．高效液相色谱测定保健食品中的黄芪甲苷中的标准曲线测定方法
【小结】
1．样品预处理：根据样品状态不同采用不同的预处理方法，再利用相似相溶粗提取要测的成分。2．分析实例中用的是反相色谱，其固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，极性小于流动相（乙腈-水；乙腈-磷酸盐；甲醇-水；甲醇-柠檬酸）。且分析的样品都是弱极性、中等极性的样品。3．含量测定：外标法（标准曲线法、峰面积法、峰高法）
【作业】
课后题 10。
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